分光光度(dù)計(jì)計采用(yòng)一(yī)個可(kě)以產生多個波(bō)長的光源(yuán)，通過(guò)係列分光(guāng)裝置，從(cóng)而產生特定波長的光(guāng)源(yuán)，光源(yuán)透(tòu)過測(cè)試的(dí)樣品後(hòu)，部(bù)分(fēn)光源被吸(xī)收，計算(suàn)樣品的吸(xī)光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃(nóng)度(dù)。樣(yàng)品的(dí)吸(xī)光值與樣(yàng)品(pǐn)的(dí)濃(nóng)度(dù)成(chéng)正(zhèng)比。 毛(máo)細管色譜柱
核(hé)酸(suān)的定(dìng)量
　　
　　核酸的(dí)定量(liáng)是(shì)分光光(guāng)度(dù)計(jì)使用頻(pín)率(shuài)zui高的(dí)功(gōng)能。可以(yǐ)定(dìng)量(liáng)溶(róng)於緩(huǎn)衝液的寡核苷(gān)酸，單鏈，雙鏈DNA，以及RNA。核酸的zui高吸(xī)收峰的吸(xī)收波長260nm。每種(zhǒng)核(hé)酸的(dí)分(fēn)子構(gòu)成不(bù)一(yī)，因此(cǐ)其換(huàn)算(suàn)係(xì)數(shù)不同。定(dìng)量不同(tóng)類型的核(hé)酸(suān)，事(shì)先要選(xuǎn)擇(zé)對應的係數。如(rú)：1OD的吸(xī)光值分別相(xiāng)當於50μg/ml的(dí)dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的(dí)Olig。測試(shì)後(hòu)的吸光(guāng)值經過上述(shù)係(xì)數的換算(suàn)，頂(dǐng)空樣品瓶從(cóng)而得(dé)出(chū)相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選(xuǎn)擇正(zhèng)確的程序，輸入(rù)原(yuán)液和稀(xī)釋液的體(tǐ)積(jī)，爾後測試空白(bái)液和(hé)樣(yàng)品(pǐn)液(yè)。然而(ér)，實驗並非一(yī)帆(fān)風(fēng)順。讀(dú)數不穩(wěn)定可能(néng)是實驗(yàn)者(zhě)zui頭(tóu)痛的問題。靈(líng)敏度(dù)越高(gāo)的(dí)儀器(qì)，表(biǎo)現出(chū)的(dí)吸光值(zhí)漂(piāo)移(yí)越大。
　　
　　事(shì)實上，分光光(guāng)度計(jì)的(dí)設計(jì)原理和(hé)工(gōng)作原理，允許(xǔ)吸(xī)光(guāng)值在(zài)一定範(fàn)圍(wéi)內變(biàn)化，即儀器有(yǒu)一(yī)定的準(zhǔn)確度和度。如EppendorfBiophotometer的(dí)準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多(duō)次測試的(dí)結果在(zài)均值1.0%左右(yòu)之間變(biàn)動(dòng)，都是正常的。另外，還(huán)需考慮(lǜ)核(hé)酸本身物化(huà)性質和溶(róng)解(jiě)核酸(suān)的緩衝液的pH值，離子濃(nóng)度等(děng)：在測(cè)試時，離(lí)子濃(nóng)度太(tài)高(gāo)，也(yě)會(huì)導致(zhì)讀(dú)數(shù)漂(piāo)移，因(yīn)此建議使(shǐ)用pH值(zhí)一(yī)定，頂空進樣(yàng)器(qì)離(lí)子濃(nóng)度(dù)較低的(dí)緩衝液(yè)，如(rú)TE，可(kě)大(dà)大(dà)穩定讀數。樣(yàng)品的稀釋(shì)濃(nóng)度(dù)同(tóng)樣是(shì)不可忽視(shì)的(dí)因素：由(yóu)於(yú)樣(yàng)品(pǐn)中不(bù)可(kě)避免存在(zài)一些細小的顆(kē)粒，尤其(qí)是核酸樣品。這些(xiē)小顆粒的存在(zài)幹(gān)擾測試效(xiào)果(guǒ)。為了(liǎo)zui大程度(dù)減少(shǎo)顆粒對(duì)測試結(jié)果(guǒ)的影響，要求(qiú)核(hé)酸吸(xī)光(guāng)值至(zhì)少大於0.1A，吸光(guāng)值(zhí)在(zài)0.1-1.。在此範(fàn)圍內，顆(kē)粒(lì)的幹擾相(xiāng)對較小，結果(guǒ)穩定(dìng)。高純(chún)氫(qīng)器發(fā)生器(qì)從(cóng)而(ér)意(yì)味(wèi)著樣品的濃度不能(néng)過低，或者過高（超(chāo)過光度(dù)計(jì)的(dí)測(cè)試範圍）。zui後是操(cāo)作因素(sù)，如混合(hé)要(yào)充(chōng)分(fēn)，否則(zé)吸光(guāng)值(zhí)太(tài)低，甚至(zhì)出現負(fù)值；混合液(yè)不能存在(zài)氣泡，空白(bái)液(yè)無懸浮(fú)物，否(fǒu)則讀數漂(piāo)移劇烈；必須使(shǐ)用相(xiāng)同的(dí)比(bǐ)色(sè)杯(bēi)測(cè)試空白液和樣(yàng)品，否(fǒu)則濃度(dù)差異太(tài)大；換(huàn)算(suàn)係(xì)數和樣品濃度單(dān)位(wèi)選(xuǎn)擇(zé)一(yī)致(zhì)；不能(néng)采用窗口磨損(sǔn)的比(bǐ)色(sè)杯(bēi)；樣(yàng)品的(dí)體積(jī)必須達到(dào)比色杯要求(qiú)的zui小體(tǐ)積等(děng)多個(gè)操作事項。